Interpretasi Prinsip Pengujian RTPCR dan Risiko COVID19

Ketika pandemi COVID-19 terus menghadirkan tantangan global, pengujian RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) tetap menjadi standar emas untuk mendiagnosis infeksi SARS-CoV-2. Namun berapa banyak yang benar-benar memahami prinsip ilmiah di balik alat diagnostik penting ini? Artikel ini memberikan penjelasan mendalam namun mudah dipahami mengenai pengujian RT-PCR, membantu profesional medis dan masyarakat umum untuk lebih memahami teknologi penting ini.

RT-PCR, atau Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, adalah teknik biologi molekuler yang sangat sensitif dan cepat yang digunakan untuk mendeteksi materi genetik tertentu dalam sampel. Materi genetik ini bisa berasal dari manusia, bakteri, atau virus seperti SARS-CoV-2.

Teknologi inti di balik RT-PCR adalah PCR, ditemukan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1980an (yang membuatnya mendapatkan Hadiah Nobel). PCR memperkuat dan mendeteksi target DNA tertentu. Perbaikan selanjutnya memungkinkan visualisasi dan kuantifikasi target DNA "waktu nyata" selama amplifikasi. Dalam PCR real-time, intensitas fluoresensi dari probe khusus berkorelasi dengan jumlah DNA yang diamplifikasi.

Namun, PCR standar hanya mendeteksi DNA. Karena SARS-CoV-2 mengandung materi genetik RNA, tes ini memerlukan enzim transkriptase balik untuk mengubah RNA menjadi DNA komplementer (cDNA). Langkah transkripsi terbalik ini, dikombinasikan dengan PCR waktu nyata, menjadikan RT-PCR alat yang ampuh untuk mendeteksi virus RNA seperti SARS-CoV-2.

Memahami RT-PCR memerlukan pengetahuan dasar tentang materi genetik—buku petunjuk yang mengatur perilaku seluler dan virus, kelangsungan hidup, dan reproduksi. Materi genetik hadir dalam dua bentuk utama: DNA (asam deoksiribonukleat) dan RNA (asam ribonukleat). DNA memiliki struktur beruntai ganda sedangkan RNA beruntai tunggal. Untuk tujuan diagnostik, stabilitas DNA yang lebih baik membuatnya lebih disukai untuk pengujian penyakit menular. Khususnya, SARS-CoV-2 hanya mengandung RNA.

Semua virus memiliki karakteristik yang sama yaitu bergantung pada sel inang untuk bertahan hidup dan bereplikasi. SARS-CoV-2, seperti virus lainnya, menyerang sel sehat untuk bereproduksi. Ketika infeksi terjadi, virus melepaskan RNA-nya dan membajak mesin seluler untuk melakukan replikasi. Selama materi genetik virus masih ada di dalam sel, RT-PCR dapat mendeteksi infeksi SARS-CoV-2.

Petugas layanan kesehatan yang terlatih mengumpulkan sampel usap nasofaring, yang kemudian ditempatkan dalam tabung steril yang berisi media transpor virus untuk menjaga integritas virus.

Di laboratorium, peneliti mengekstraksi RNA menggunakan alat pemurnian komersial. Sampel RNA kemudian ditambahkan ke campuran reaksi yang mengandung semua komponen yang diperlukan untuk pengujian, termasuk DNA polimerase, transkriptase balik, bahan penyusun DNA, serta probe dan primer fluoresen khusus SARS-CoV-2.

Karena PCR hanya bekerja dengan templat DNA, transkriptase balik mengubah semua RNA dalam sampel (termasuk RNA manusia, bakteri, virus corona lainnya, dan kemungkinan RNA SARS-CoV-2) menjadi cDNA.

Proses ini melibatkan tiga langkah berulang:

• Denaturasi:Pemanasan DNA hingga >90°C selama sekitar 10 menit akan memisahkan DNA untai ganda menjadi untai tunggal.
• Anil Primer:Fragmen DNA pendek (primer) yang dirancang khusus menempel pada target cDNA SARS-CoV-2 tertentu pada suhu yang lebih rendah. Target gen umum COVID-19 meliputi RNA-dependent RNA polimerase (RdRP), ORF1ab, gen S (spike protein), gen N (nukleokapsid), dan gen E (envelope).
• Perpanjangan:DNA polimerase menggunakan primer sebagai titik awal untuk membuat salinan identik dari segmen DNA target.

Proses ini biasanya berulang sebanyak 40 kali, menggandakan DNA target pada setiap siklus. Probe fluoresen mengikat bagian hilir primer, melepaskan sinyal yang dapat dideteksi pada setiap amplifikasi DNA. Peningkatan DNA target berkorelasi dengan peningkatan intensitas fluoresensi.

Data fluoresensi menghasilkan nilai "Cycle Threshold" (Ct)—jumlah siklus yang diperlukan agar sinyal melampaui tingkat latar belakang. Sampel dengan DNA target lebih banyak teramplifikasi lebih cepat, memerlukan siklus lebih sedikit (nilai Ct lebih rendah). Sebaliknya, DNA target yang langka memerlukan lebih banyak siklus (nilai Ct lebih tinggi).

Nilai Ct memberikan informasi penting tentang viral load. Nilai Ct yang lebih rendah menunjukkan jumlah genom virus yang lebih tinggi, sedangkan nilai yang lebih tinggi menunjukkan jumlah yang lebih rendah. Penyedia layanan kesehatan menggabungkan nilai Ct dengan gejala klinis dan riwayat untuk menilai stadium penyakit. Nilai serial Ct dari pengujian berulang membantu memantau perkembangan penyakit dan memprediksi pemulihan. Pelacak kontak juga menggunakan nilai Ct untuk memprioritaskan pasien dengan viral load tertinggi (dan dengan demikian memiliki risiko penularan terbesar).

• Beban Viral:Nilai Ct berkorelasi terbalik dengan viral load—Ct yang lebih rendah berarti lebih banyak virus yang ada.
• Stadium Penyakit:Infeksi awal biasanya menunjukkan viral load yang tinggi (Ct rendah), sedangkan tahap selanjutnya menunjukkan penurunan viral load (meningkatkan Ct) ketika sistem kekebalan tubuh memberantas infeksi.
• Resiko Penularan:Viral load yang lebih tinggi (nilai Ct yang lebih rendah) menunjukkan potensi penularan yang lebih besar, sehingga memerlukan tindakan isolasi yang lebih ketat.

Meskipun merupakan standar emas diagnostik COVID-19, RT-PCR memiliki keterbatasan:

• Negatif Palsu:Pengambilan sampel yang tidak tepat, viral load yang rendah, atau pengujian dini dapat memberikan hasil negatif meskipun sebenarnya sudah terinfeksi.
• Positif Palsu:Hasil positif yang jarang namun mungkin terjadi tanpa adanya infeksi sebenarnya.
• Tantangan Standardisasi:Lab dan platform yang berbeda mungkin menggunakan ambang batas Ct yang berbeda-beda, sehingga mempersulit perbandingan.

Tes RT-PCR tetap penting untuk diagnosis COVID-19 dengan mendeteksi materi genetik SARS-CoV-2. Nilai Ct berfungsi sebagai indikator penting dari viral load, perkembangan penyakit, dan risiko penularan. Namun, keterbatasan tes memerlukan penggabungan hasil dengan evaluasi klinis untuk diagnosis dan penatalaksanaan yang akurat.